為使亞克隆實(shí)驗成功，并能在未獲得目的克隆時(shí)，查明實(shí)驗失敗的原因，每次實(shí)驗應包括相應的對照。其中包括：

感受態(tài)細胞的轉化效率

抗菌素是否有效

連接的效率

未連接質(zhì)粒的背景

磷酸酶處理的效果

轉化效率1×10⁶ cfu/mgDNA可滿(mǎn)足普通的亞克隆實(shí)驗；1×10⁷ cfu/mgDNA用于作更復雜的亞克隆，有限量的DNA的轉化，T-克隆實(shí)驗；構建文庫和突變要求用的轉化的效率為>1×10⁸ cfu/mgDNA。

4、 使用pGEM載體克隆大片段時(shí)（＞7-8Kb），轉化時(shí)菌株在30℃而不是37℃生長(cháng)，更有利于細胞的復蘇。

為檢測連接反應的效果，線(xiàn)化（單限制性酶切，非磷酸酶處理）質(zhì)粒需同實(shí)驗樣品平行連接。取一部分連接反應液用于轉化，隨后涂布到選擇培養基上。平板上所生長(cháng)的菌落數，可同相同量、未連接的線(xiàn)化質(zhì)粒、轉化相同數目的細菌后，涂布在選擇培養基上所生長(cháng)的菌落數比較。如果連接成功，自連接質(zhì)粒在平板上的菌落數，會(huì )遠遠高于未連接的線(xiàn)化質(zhì)粒轉化細菌所得的菌落數。如果線(xiàn)化成功，未連接的線(xiàn)化質(zhì)粒（未連接的質(zhì)粒背景）所得的菌落數應很低。如連接效率高，則自連質(zhì)粒所得的菌落數應同用完整質(zhì)粒轉化細菌所得的菌落數相近。 另一種非定量的方法是將等量的未連接質(zhì)粒和連接質(zhì)粒在瓊脂上電泳，連接后的樣品的遷移率會(huì )降低。

1．確認Insert DNA片段的3＇末端是否帶有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶（如：Pyrobest、PrimeSTAR HS、KOD、Pfx、Pfu等）擴增的PCR產(chǎn)物是平滑末端，不能直接進(jìn)行TA克隆。

2．純化PCR產(chǎn)物。最好使用切膠回收的PCR片段，以除去PCR產(chǎn)物中的非特異性片段和引物等雜質(zhì)。進(jìn)行切膠回收時(shí)可以使用莊盟是生物的小量瓊脂糖凝膠回收試劑盒（ZP202）。

3．請使用轉化效率大于10⁸cfu/μg pUC19 DNA的感受態(tài)細胞。

4．DNA片段的立體結構、DNA片段的長(cháng)短都會(huì )影響克隆效率。一般情況下，大片段DNA的克隆效率（連接效率與轉化效率）偏低，此時(shí)可以延長(cháng)連接反應時(shí)間，或采用電轉化方法。

5．進(jìn)行切膠回收純化DNA片段時(shí)，不要使DNA片段在紫外線(xiàn)下暴露時(shí)間過(guò)長(cháng)。

6．建議使用新配制的平板培養基。

陽(yáng)性克隆鑒定方法有哪些?

1．藍白斑篩選。

藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法，一般情況下，β-半乳糖苷酶的表達將受到破壞，重組克隆體在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養基上培養時(shí)將顯示白色菌落。但有時(shí)比較短的DNA片段插入載體時(shí)，基因的讀碼框有可能正好與LacZ的讀碼框相吻合，克隆體也會(huì )顯示藍色菌落。有報道稱(chēng)，2 kbp的DNA片段插入到載體中后，重組克隆體仍顯示了藍色。所以，當我們沒(méi)有得到白色菌落時(shí)，可以試著(zhù)檢測藍色菌落。

2．菌落PCR方法。

以變性后的菌液為模板，使用載體通用引物進(jìn)行PCR擴增鑒定。

使用滅菌后的牙簽挑取白色菌落，在預備好的ddH2O（10μl）中蘸洗，99℃，10 min變性，冰上急冷，加入配制好的PCR混合液（引物，dNTP，Buffer， Taq等）。

94℃   1 min

94℃   30 sec

55℃   30 sec        30 Cycles

72℃   1 kbp/min

說(shuō)明： a．所用引物通常為載體通用引物。

以提純后的質(zhì)粒DNA為模板，使用PCR擴增引物進(jìn)行PCR擴增鑒定。

94℃   1 min

94℃   30 sec

55℃   30 sec       30 Cycles

72℃   1 kbp/min

說(shuō)明：擴增產(chǎn)物的大小就是PCR產(chǎn)物的大小。

利用載體多克隆位點(diǎn)上限制酶或者PCR引物導入酶切位點(diǎn)的限制酶，對提純后的質(zhì)粒DNA進(jìn) 行雙酶切鑒定。 說(shuō)明：雙酶切后，電泳顯示兩條帶，分別為載體大小和PCR產(chǎn)物的大小。

1 問(wèn)題：做轉化時(shí)，用藍白斑篩選，以獲得陽(yáng)性克隆。那它和直接利用AMP抗性，而不用藍白斑篩選，有什么區別嗎？藍白斑篩選有什么作用嗎？

對于這一問(wèn)題，我想，抗性篩選是防止雜菌生長(cháng)。理論上說(shuō)，當培養基中含有抗生素時(shí)，只有攜帶相應抗藥性基因載體的細胞才能生存繁殖。藍白篩選是驗證是否有插入片斷。兩者結合起來(lái)，更有利于篩選到我們的目的菌。

2 問(wèn)題：如果加了AMP、IPTG和X-Gal，長(cháng)出來(lái)的白斑一定都是含有插入片段的嗎？有沒(méi)有可能是載體自連的？

答：可以說(shuō)，世界上沒(méi)有絕對的事情，即使加了AMP、IPTG和X-Gal，長(cháng)出來(lái)的白斑也不一定都是含有插入片段的陽(yáng)性克隆，具體原因可能有：
1）有可能是載體自連的假陽(yáng)性；
2）作時(shí)AMP、IPTG和X-Gal其中一種或幾種沒(méi)涂均勻。
3）有時(shí)即使插入片段也會(huì )出現籃斑。只要編碼框沒(méi)被破壞。

3 問(wèn)題：如何篩選重組菌落?

答：可使用藍/白斑篩選法，在涂布有IPTG和X-Gal的篩選平板上，重組菌株為白色，未轉入重組質(zhì)粒的菌株為藍色。

4 問(wèn)題：藍白斑篩選如何篩選合適的宿主菌株?

答：如進(jìn)行藍/白斑篩選，宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽編碼區應在染色體或附加體上缺失掉（lacZΔΜ15）。TOP10和DH5α都能用于藍/白斑篩選。

5 問(wèn)題：在藍白斑篩選的過(guò)程中沒(méi)有藍斑是什么原因導致的？因為通過(guò)PCR檢測插入片段的大小表明所挑的白斑克隆并沒(méi)有插入片段。

答：原因很多，

1）可能是你用的培養基含有乳糖或葡萄糖，因為半乳糖甘酶會(huì )分解乳糖，導致不能與X-Gal反應，葡萄糖不會(huì )誘導融合基因的表達。

2）作時(shí)AMP、IPTG和X-Gal其中一種或幾種沒(méi)涂均勻。

3）很多因素會(huì )造成PCR失敗。

6 問(wèn)題：我最近轉化大腸桿菌時(shí)，通過(guò)藍白斑篩選，挑出白色菌落做PCR，可是在電泳時(shí)發(fā)現在有目的帶的同時(shí)還有比目的帶小的雜帶，不知為什么？我反復篩了幾次，都是這樣，可不可以搖菌提質(zhì)粒？我應該下一步怎么做？

答：針對這樣的情況，我覺(jué)得，你首先做酶切鑒定，看看你的目的片段是否真正插入。其次，你應該檢測PCR過(guò)程有沒(méi)有問(wèn)題。

7 問(wèn)題：我用Amp-IPTG-X-gal LB平板進(jìn)行藍白斑篩選重組子，為何篩出的全是白斑，沒(méi)一個(gè)藍斑，挑幾個(gè)白斑搖菌擴增后PCR檢測也全是陽(yáng)性克隆，不會(huì )全都重組成功了吧？什么原因呢？

答：這樣的情況是完全有可能的，只要載體處理的好，應該說(shuō)是有這種可能。